Proiect PN-II-PT-PCCA-2013-4-1572 (Contract. Nr. 161 /2014)
Acronimul proiectului: SALIFEROVEG
Studii privind corelaţiile sol-plantă-aliment-om în vederea obţinerii unui supliment alimentar
cu un conţinut crescut în fier de origine vegetală
Director proiect: Prof. dr. farm. Robert Ancuceanu
Sursa de finanţare
UEFISCDI: PARTENERIATE IN DOMENIILE PRIORITARE - Proiecte colaborative de cercetare aplicativa ( http://uefiscdi.gov.ro/articole/2992/Proiecte-colaborative-de-cercetare-aplicativa.html )
Descrierea proiectului
Anemia feriprivă (AF) este cea mai răspândită formă de anemie din lume şi cea mai frecventă formă a anemiei la femeile gravide. Se estimează că AF are o prevalenţă de 2% la bărbaţii adulţi şi 9-20% la femeile adulte. Numeroasele efecte negative ale anemiei asupra sănătăţii şi calităţii vieţii justifică intervenţiile destinate să prevină şi să controleze anemia, iar cea mai importantă dintre acestea este utilizarea de suplimente alimentare cu fier.
Obiectivul principal al proiectului constă în dezvoltarea unui supliment alimentar cu fier, utilizând fier în forma sa naturală, sub forma unui extract din plante bogat în acest oligoelement, iar în acest scop se vor explora corelaţiile dintre sol, plante şi procesele de extracţie care vor sta la baza suplimentului alimentar dezvoltat, pentru a asigura o utilizare optimă la om. Există foarte puţine suplimente alimentare de origine vegetală care conţin fier pe piaţa românească (majoritatea celor disponibile conţin săruri de fier). Există doar un supliment alimentar de origine chineză cu fier (10 mg/comprimat) şi acid folic, fierul provenind dintr-un aşa-numit "praf negru de fungi" (fără nici o identificare taxonomică a speciilor de fungi) şi unul fabricat la nivel local (cu două formule uşor diferite), dar cu o cantitate foarte mică de fier ("Fier biologic", care asigură un aport de Fe mai mic de 1,0 mg pe capsulă).
În acest scop vom explora corelaţia dintre fierul din sol şi cel din plante, analizând conţinutul de fier în cel puţin 6 specii vegetale (cel puţin 2 organe ale acestora -rădăcină, tulpină, frunze, seminţe) cultivate pe diferite soluri din România şi folosind metode statistice de regresie pentru a verifica relaţia dintre cele două variabile. Deoarece aşa cum se arată în secţiunea 1.2. - biodisponibilitatea fierului este cel mai frecvent afectată de alţi compuşi din plante (în special fitaţi, polifenoli şi flavonoide), vom investiga şi influenţa solului asupra conţinutului în flavonoide şi polifenoli (nu vom investiga fitaţii deoarece sunt cel mai adesea prezenţi în cantităţi semnificative numai în seminţe şi cereale).
Foarte puţine cercetări s-au referit până acum la corelaţia dintre preluarea fierului din sol şi conţinutul în polifenoli sau flavonoide în diferitele părţi ale plantei. Vom explora şi relaţiile dintre etapele de dezvoltare ontogenetică ale plantei şi preluarea fierului din sol. Studiile publicate până acum au analizat această relaţie doar la un număr mic de specii şi au avut rezultate contradictorii. Rezultatele ne vor permite să luăm o decizie ştiinţifică fundamentată privind speciile de utilizat ca materie primă, stadiul de creştere la care să fie recoltate şi de pe ce tip de sol. Vom investiga şi cea mai bună metodă de extracţie a fierului din surse vegetale şi principalele variabile care afectează eficienţa procesului de extracţie a fierului (vor fi investigate următoarele variabile: metoda de extracţie, solventul, temperatura, raportul produs vegetal: solvent, timpul de extracţie şi gradul de mărunţire) şi posibilitatea obţinerii şi caracterizării unui extract standardizat (materie primă pentru un produs finit). În cele din urmă, vom formula şi dezvolta un supliment alimentar cu fier de origine vegetală la stadiul de prototip.
Proiectul se va realiza prin colaborarea a trei parteneri: Universitatea de Medicină si Farmacie "Carol Davila" Bucureşti (cu o echipă multidisciplinară de experţi in botanică farmaceutică, fitochimie, chimie analitică, chimie fizică, chimie farmaceutică, farmacologie, tehnologie farmaceutică), SC Hofigal Export Import, unul dintre cei mai importanţi producători de suplimente alimentare de origine de origine vegetală de pe piaţa romaneasca si SC Agroeco Biottera SRL, o companie specializată în cultivarea ecologică aspeciilor medicinale vegetale, fiind certificată în acest sens.
Echipa de cercetare
1. Conf. univ. dr. Robert Ancuceanu - director de proiect
2. Dr. Farm. Violeta Camen Popescu - responsabil proiect, S.C. Hofigal Import Export S.A.
3. Geta Stocheci - responsabil proiect, S.C. Agroecobioterra SRL
4. Prof. univ. dr. Mihaela Dinu (UMF „Carol Davila) - cercetător
5. Prof. univ. dr. Valentina Uivaroşi (UMF „Carol Davila) - cercetător
6. Conf. univ. dr. Alexandra Filareta Neagu (UMF „Carol Davila) - cercetător
7. Prof. univ. dr. Cristina Dinu Pîrvu (UMF „Carol Davila) - cercetător
8. Conf. univ. dr. Mircea Hîrjău (UMF „Carol Davila) - cercetător
9. Şef lucr. dr. Marilena Viorica Hovaneţ (UMF „Carol Davila) - cercetător
10. Asist. univ. dr. Adriana Iuliana Anghel (UMF „Carol Davila) - cercetător
11. Asist. univ. dr. Octavian Olaru (UMF „Carol Davila) - cercetător
12. Conf. univ. dr. Corina Cristina Aramă (UMF „Carol Davila) - cercetător
13. Ş.l. dr. Bruno Velescu (UMF „Carol Davila) - cercetător
14. Conf. univ. dr. Mihai Niţulescu (UMF „Carol Davila) - cercetător
15. Prof. univ. dr. Simona Negreş (UMF „Carol Davila) - cercetător
16. Conf. univ. dr. Cornel Chiriţă (UMF „Carol Davila) - cercetător
17. Conf. univ. dr. Corina Ana Ioniţă (UMF „Carol Davila) - cercetător
18. Ş.l. dr. Elena Moroşan (UMF „Carol Davila) - cercetător
19. Ec. Cecilia Niţă (UMF „Carol Davila) - personal tehnic
20. Ec. Alina Mihaela Ciudin - (UMF „Carol Davila) - personal tehnic
21. Alina Dune (S.C. Hofigal Import Export) - cercetător
22. Florentina Steluta Dociu (S.C. Hofigal Import Export) - cercetător
23. Maria Ciolea (S.C. Hofigal Import Export) - cercetător
24. Emilia Tanasa (S.C. Hofigal Import Export) - personal tehnic
25. Larisa Petcu (S.C. Hofigal Import Export) - cercetător
26. Mariana Fotescu (S.C. Hofigal Import Export) - cercetător
27. Şerban Aurelia (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
28. Lenuţa Olaru (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
29. Costel Sahaidac (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
30. Ancuţa Negraru (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
31. Aurelia Zidaru (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
32. Elena Palangeanu (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
33. Ilie Coman (S.C. Agroecobioterra SRL) - personal tehnic
Rezultate preconizate:
Rezultatele estimate: î n urma realizării
activităţilor de cercetare din proiect, se estimează
realizarea următoarelor rezultate:
1.Înţelegerea
corelaţiilor dintre caracteristicile solului şi conţinutul
de fier din speciile vegetale investigate.
2.Înţelegerea
influenţei stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra
conţinutului în fier la speciile investigate.
3.Înţelegerea corelaţiilor dintre
caracteristicile solului şi conţinutul în alte
minerale (decât fierul) din speciile vegetale.
4.Înţelegerea
influenţei stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra
conţinutului în alte minerale la speciile investigate.
5.Înţelegerea corelaţiilor dintre
caracteristicile solului şi conţinutul în polifenoli
din speciile vegetale investigate.
6.Înţelegerea
influenţei stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra
conţinutului în polifenoli la speciile studiate.
7.Înţelegerea corelaţiilor dintre
caracteristicile solului şi conţinutul în flavonoide
al speciilor vegetale investigate.
8.Înţelegerea
influenţei stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra
conţinutului în flavonoide la speciile studiate.
9.Înţelegerea corelaţiilor dintre
caracteristicile solului şi conţinutul în acid
ascorbic din speciile vegetale investigate.
10. Înţelegerea
influenţei stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra
conţinutului în acid ascorbic la speciile vegetale
studiate.
11.Înţelegerea influenţei metodei de
extracţie asupra randamentului de extracţie (pentru
fier,polifenoli, flavonoide şi acid ascorbic).
12.Înţelegerea
influenţei solventului asupra randamentului de extracţie
(pentru fier,polifenoli, flavonoide şi acid ascorbic).
13.Înţelegerea influenţei temperaturii asupra
randamentului de extracţie (pentru fier,polifenoli, flavonoide
şi acid ascorbic).
14.Înţelegerea influenţei
raportului solvent:produs vegetal asupra randamentului de extracţie
(pentru fier,polifenoli, flavonoide şi acid ascorbic).
15.Înţelegerea influenţei duratei de extracţie
asupra randamentului de extracţie (pentru fier,polifenoli,
flavonoide şi acid ascorbic).
16.Înţelegerea
influenţei gradului de mărunţire (dimensiunii
particulelor) produsului vegetal asupra randamentului de extracţie
(pentru fier,polifenoli, flavonoide şi acid ascorbic).
17.Obţinerea unui extract vegetal standardizat, bogat în
fier şi caracterizarea fizico-chimică şi
microbiologică a acestuia.
18.Evaluarea genotoxicităţii
extractului obţinut, pe celule vegetale şi animale.
19.Evaluarea disponibilităţii fierului pe baza unei
metode in vitro validate.
20.Obţinerea unui prototip al
produsului finit (Pi) - un supliment alimentar conţinând
fier de origine vegetală.
21.Diseminare: cel puţin 3
articole ISI şi cel puţin 3 comunicări la conferinţe
naţionale/internaţionale; 1 brevet naţional.
Etapa I - Stadiul şi rezultatele obţinute
Activităţile realizate în cadrul Etapei I/2014 a proiectului („Activităţi preliminare"), de către Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila" (în continuare, UMF „Carol Davila"), Bucureşti, în calitate de coordonator şi cei doi parteneri, S.C. Hofigal Export Import S.A. şi S.C. Agroeco Bioterra S.R.L., au avut în vedere următoarele obiective:
1. Cultivarea plantelor de studiat (în câmp sau în sere), colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi.
2. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate.
3. Dezvoltarea şi validarea metodei de dozare a fierului şi altor minerale
4. Dezvoltarea şi validarea metodei de dozare a polifenolilor.
5. Dezvoltarea şi validarea metodei de dozare a flavonoidelor.
6. Dezvoltarea şi validarea metodei de dozare a acidului ascorbic.
În această primă etapă s-au realizat activităţi preliminare care să permită realizarea proiectului experimental complex care corespunde etapei următoare a realizării proiectului.
1. Cultivarea plantelor de studiat (în câmp sau în sere), colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi. Deoarece iniţierea activităţilor a avut loc în a doua perioadă a anului, nu s-au putut cultiva de novo speciile vegetale care fac obiectul proiectului, ci s-au utilizat produse vegetale uscate, cultivate de partenerii din proiect în perioada anterioară iniţierii proiectului şi s-au făcut pregătirile pentru cultivarea plantelor de studiu în etapa următoare.
2. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate. S-au aplicat criteriile de identificare macro- şi microscopică la speciile vegetale care fac obiectul studiului, verificându-se şi stabilindu-se principalele elemente histo-anatomice particulare fiecărei specii şi fiecărui organ analizat. Caracterele macroscopice sunt uşor accesibile în literatura de specialitate, pe când cele microscopice sunt accesibile doar parţial (în special pentru examinările în pulbere sau în preparate superficiale clarificate).
3. Dezvoltarea şi validarea metodei de dozare a fierului şi altor minerale. Dozarea fierului şi altor oligoelemente (zinc, crom, plumb, cupru, mangan şi cadmiu) se efectuează prin spectrometrie de absorbţie atomica AAS conform Farmacopeei Europene, ediţia in vigoare. Validarea metodei de dozare s-a realizat pe Liquiritiae radix (rădăcina speciei Glycyrrhiza glabra L.). S-au confirmat linearitatea, repetabilitatea şi precizia intermediară, acurateţea şi sensibilitatea metodei. Specificitatea urmează a fi verificată pentru fiecare produs vegetal în parte înainte de prima aplicare a metodei.
4. Pentru determinarea cantitativă a polifenolilor s-a aplicat metoda spectrofotometrică cu reactiv Folin-Ciocâlteu (metoda echivalenţei în acid galic). Validarea metodei de dozare s-a realizat pe Liquiritiae folium (frunza speciei Glycyrrhiza glabra L.), frunza fiind o matrice analitică mai complexă decât rădăcina sau tulpina. S-au confirmat linearitatea, repetabilitatea şi precizia intermediară, acurateţea şi sensibilitatea metodei. Specificitatea urmează a fi verificată pentru fiecare produs vegetal în parte înainte de prima aplicare a metodei.
5. Pentru determinarea cantitativă a flavonoidelor s-a utilizat metoda bazată pe chelatarea acestora cu clorură de aluminiu în mediu uşor alcalin, utilizând drept substanţă de referinţă quercetolul (Merck). Şi pentru această metodă s-au confirmat linearitatea, repetabilitatea şi precizia intermediară, acurateţea şi sensibilitatea.
6. Pentru dozarea acidului ascorbic s-a dezvoltat o metodă HPLC bazată pe o fază staţionară de tip amino (Microsorb 100-5 Amino, part. 5 mm) şi o fază mobilă constând dintr-un amestec de acid orto-fosforic 0,1% (A) şi acetonitril (B), separarea fiind realizată în condiţii izocratice (20% A, 80% B), pentru care s-a evaluat linearitatea şi sensibilitatea. Deoarece niciun produs vegetal uscat provenit de la cele şase specii vegetale (cu cel puţin 2 organe vegetative fiecare) nu a conţinut cantităţi detectabile de acid ascorbic (sub limita de detecţie), nu s-au investigat precizia şi acurateţea metodei.
Etapa II - Stadiul şi rezultatele obţinute
Activităţile realizate în cadrul Etapei 2/2015 a proiectului („Studiul influenţei solului şi stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra conţinutului de fier, polifenoli, flavone şi acid ascorbic din plante - partea 1“), au avut în vedere următoarele obiective, orientate spre investigarea influenţei solului şi stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra conţinutului de fier, polifenoli, flavone şi acid ascorbic din plante:
1. Cultivarea plantelor de studiat, colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi (cel puţin 6 specii, cel puţin 3 soluri, cel puţin 3 stadii de vegetaţie).
2. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate.
3. Identificarea şi dozarea fierului din produsele vegetale provenite de pe soluri diferite şi prelevate la stadii de dezvoltare diferite.
4. Identificarea şi dozarea altor minerale din produsele vegetale (parţial).
5. Identificarea şi dozarea polifenolilor din produsele vegetale.
6. Identificarea şi dozarea flavonelor din produsele vegetale (parţial).
Activităţile iniţiate în cadrul acestei etape urmează să fie finalizate şi integrate în etapa următoare a realizării proiectului, ele permiţând dezvoltarea unui număr de 10 modele experimentale (EM 1-10) descriind corelaţiile între sol şi, respectiv, stadiile de dezvoltare ontogenetică şi conţinutul în fier, alte oligoelemente, polifenoli, flavone şi acid ascorbic din speciile vegetale, la nivelul fiecărui organ.
1. Cultivarea plantelor de studiat (în câmp sau în sere), colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi. Având în vedere obiectivele acestei etape, un număr de 7 specii vegetale au fost cultivate în condiţiile prevăzute în protocolul de lucru: cultivare pe 3 soluri diferite (un preluvosol cu textura luto-argiloasa spre luto-nisipoasa, cu structura glomerulara; un preluvosol cu textură argiloasa bogat in carbonati şi cermisol si cernoziom de tip cambic si argic,bogat in humus) şi colectare la 3 stadii de dezvoltare ontogenetica diferite (înainte de înflorire, la stadiul de boboc şi la anteză).
2. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate. Acestea s-au realizat ca şi în cadrul primei etape prin metodele simple şi clasice ale analizei farmacognostice aşa cum au fost prezentate în raportul precedent. A fost introdusă suplimentar specia Plantago lanceolata L. în studiu, deoarece din motive eco-botanice Acorus calamus L. a fost disponibilă pentru colectare şi analiză numai în stadiul I, aşa cum se detaliează în prezentul raport.
3. Identificarea şi dozarea fierului. S-a realizat prin prin spectrometrie de absorbţie atomica AAS conform Farmacopeei Europene, ediţia in vigoare, pentru cele 7 specii vegetale. În esenţă, se observă o influenţă mult mai limitată a solului în comparaţie cu stadiul de dezvoltare ontogenetică (sau cu organul vegetal analizat). În general s-a observat o creştere a conţinutului în fier în cursul primelor trei stadii de dezvoltare ontogenetică, similar datelor raportate în literatură pentru Phaseolus vulgaris, dar diferit de datele raportate pentru Lactuca sativa.
4. Identificarea şi dozarea altor minerale (prima parte). În cadrul acestei activităţi, alte minerale (Ca, Mg, Na, K, Mn etc) au fost dozate în produsele vegetale provenite de la Tagetes erecta L. Pentru celelalte specii, determinările urmează a fi realizate în etapa următoare a proiectului.
5. Pentru determinarea cantitativă a polifenolilor s-a aplicat metoda spectrofotometrică cu reactiv Folin-Ciocâlteu (metoda echivalenţei în acid galic). S-a determinat conţinutul în polifenoli în toate organele vegetative ale speciilor analizate, de pe cele 3 soluri, în primele stadii de dezvoltare ontogenetică (până la înflorire, inclusiv). Diferenţele dintre stadiile de dezvoltare sunt în general mai importante decât diferenţele dintre soluri, iar variaţia între stadiile de dezvoltare nu este pur lineară, ci mai complexă, trebuind abordată distinct pentru fiecare specie.
6. Pentru determinarea cantitativă a flavonoidelor s-a utilizat metoda bazată pe chelatarea acestora cu clorură de aluminiu în mediu uşor alcalin, utilizând drept substanţă de referinţă quercetolul (Merck). Metoda a fost aplicată în această etapă la o parte din produsele vegetale provenite de la Urtica dioica, Tagetes erecta şi Glycyrrhiza glabra. De asemenea, s-a încercat dozarea flavonoidelor din Petroselinum crispum, dar metoda cu clorură de aluminiu nu a putut fi aplicată la niciunul din organele vegetative ale speciei, absorbanţa soluţiilor tratate cu acest reactiv fiind mai mică decât cea a probei blanc (culoarea galbenă a soluţiei extractive fiind în mod vizibil mai palidă la proba de analizat în comparaţie cu martorul).
Etapa III - Stadiul şi rezultatele obţinute
Activităţile realizate în cadrul Etapei 3/2016 a proiectului de către Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila“ (în continuare, UMF „Carol Davila“), Bucureşti, în calitate de coordonator şi cei doi parteneri, S.C. Hofigal Export Import S.A. şi S.C. Agroeco Bioterra S.R.L., au avut în vedere următoarele obiective, orientate spre investigarea influenţei solului şi stadiului de dezvoltare ontogenetică asupra conţinutului de fier, polifenoli, flavone şi acid ascorbic din plante (acestea sunt prezentate în ordinea activităţilor alocate acestei etape):
1. Identificarea şi dozarea altor oligoelemente din produsele vegetale (parţial).
2. Identificarea şi dozarea flavonelor din produsele vegetale (parţial).
3. Identificarea și dozarea acidului ascorbic
4. Analizele chimice ale solurilor de pe care a fost recoltat materialul vegetal
5. Investigarea factorilor care influențează randamentul de extracție:
a. Metoda de extracție
b. Solventul
c. Temperatura
d. Raportul solvent: produs vegetal
e. Durata de extracție
f. Gradul de mărunțire a produsului vegetal
6. Cultivarea plantelor de studiat, colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi (cel puţin 6 specii, cel puţin 3 soluri, cel puţin 3 stadii de vegetaţie).
7. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate.
Activităţile realizate în cadrul acestei etape, integrate cu cele din etapa precedentă a realizării proiectului au permis dezvoltarea unui număr de 16 modele funcţionale (FM 1-16) descriind corelaţiile între sol şi, respectiv, stadiile de dezvoltare ontogenetică şi conţinutul în fier, alte oligoelemente, polifenoli, flavone şi acid ascorbic din speciile vegetale, la nivelul fiecărui organ.
1. Identificarea şi dozarea altor minerale (partea a doua). În cadrul acestei activităţi, alte minerale (Ca, Mg, Na, K, Mn etc) au fost dozate în produsele vegetale provenite de la Glycyrrhiza glabra L., Petroselinum crispum (Mill.) Fuss (sin. Petroselinum sativum Hoffm.), Plantago lanceolata L., Mentha x piperita L. şi Acorus calamus L. Au existat interacţiuni semnificative şi complexe între sol, stadiul de dezvoltare şi conţinutul în fier sau alte minerale.
2. Determinarea cantitativă a flavonoidelor (partea a doua) a fost continuată pentru Urtica dioica, Tagetes erecta, Glycyrrhiza glabra și Petroselinum crispum (Mill.) Fuss (stadiile II și III) şi a fost realizată complet pentru Plantago lanceolata L., Mentha x piperita L. şi Acorus calamus L.Au existat interacţiuni semnificative şi complexe între sol, stadiul de dezvoltare şi conţinutul în flavonoide.
3. Identificarea şi dozarea acidului ascorbic. Așa cum am arătat în cadrul primei etape, cu ocazia validării metodei de dozare a acidului ascorbic, în toate cele 6 produse vegetale uscate, acidul ascorbic este complet degradat și prin urmare este imposibilă dozarea acestuia. De aceea, ținând cont că și alți acizi organici (citric, malic etc) pot influența absorbția fierului, ne-am propus evaluarea conținutului în acizi organici în soluțiile extractive apoase din fiecare din produsele vegetale analizate prin măsurarea pH-ului acestora. Dintre speciile analizate, valorile de pH au avut tendinţa să fie cele mai scăzute la Tagetes ercta L, Acorus calamus L. şi Plantago lanceolata L. (cel mai frecvent sub 6.00).
4. Analizele chimice ale solurilor de pe care a fost recoltat materialul vegetal s-au realizat pe un număr total de 12 eşantioane - 4 pentru solul C, 5 pentru solul PC și 3 pentru solul PR și au vizat principalele elemente analizate și în produsele vegetale studiate în cadrul proiectului (Fe, Na, K, Ca, Mg, Cd, Cu, Cr, Mn, Zn). Diferenţe remarcabile au fost observate pentru câteva elemente (în principal Zn, Cu şi Cd), mai ales pentru solul PR, în comparaţie cu solurile C şi PC, acestea din urmă fiind mai similare între ele în privinţa elementelor analizate.
5. Investigarea factorilor care influențează randamentul de extracție (activitățile 3.5-3.10) a inclus următoarele variabile, fiecare cu cel puțin trei valori distincte:
a. Metoda de extracție (macerare la rece, refluxare la cald, extracție cu ultrasunete la cald, extracție cu microunde);
b. Solventul (au fost investigați șase solvenți diferiți: apă distilată, metanol 50%, metanol 50% acidulat cu acid citric 3%, metanol 50% acidulat cu HCl 1N, apă acidulat cu acid citric 3% și apă acidulată cu HCl 1N);
c. Temperatura (au fost evaluate trei temperaturi la refluxare: 65 °C, 80 °C și 100 °C, precum și temperatura camerei 20-25°C la macerare, timp de 40 ore);
d. Raportul solvent: produs vegetal (au fost evaluate 3 rapoarte, la refluxare: 100:15, 100:5 și 100:2)
e. Durata de extracție (au fost evaluate 4 durate de extracție prin refluxare: 10 minute, 20 minute, 30 minute, 60 minute)
f. Gradul de mărunțire a produsului vegetal (au fost evaluate 3 dimensiuni ale pulberii vegetale: 20 μm, 100 μm și 500 μm).
Rezultatele vor fi utilizate la obţinerea extractului final şi mai întâi brevetate, iar ulterior publicate.
6. Cultivarea plantelor de studiat (în câmp sau în sere), colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiu în vederea realizării celorlalte activităţi, inclusiv din anul următor. Având în vedere obiectivele acestei etape, un număr de 7 specii vegetale au fost cultivate în condiţiile prevăzute în protocolul de lucru: cultivare pe 3 soluri diferite (un preluvosol cu textură luto-argiloasă spre luto-nisipoasă, cu structură glomerulară; un preluvosol cu textură argiloasă bogat în carbonaţi şi cermisol şi cernoziom de tip cambic şi argic, bogat în humus) şi colectare la 3 stadii de dezvoltare ontogenetică diferite (înainte de înflorire, la stadiul de boboc şi la anteză).
7. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate. Acestea s-au realizat ca şi în cadrul primei etape prin metodele simple şi clasice ale analizei farmacognostice aşa cum au fost prezentate în raportul precedent. În această etapă s-au utilizat în principal examene macroscopice și mai puțin cele microscopice; având în vedere achiziționarea unui microscop digital Leica DMS 1000, am analizat fiecare din pulberi (fără clarificare sau procesare prealabilă) și cu acest microscop, pentru a investiga posibilitatea utilizării acestui tip de microscopie în identificarea și evaluarea purității produselor vegetale analizate.
Etapa IV - Stadiul şi rezultatele obţinute
Activităţile realizate în cadrul acestei ultime etape au avut în vedere următoarele obiective, orientate spre obţinerea extractului standardizat pornind de la materia primă şi un supliment alimentar bogat în fier de origine vegetală (acestea sunt prezentate în ordinea activităţilor alocate acestei etape):
Obţinerea extractului standardizat (extract lichid, moale sau uscat; dacă este lichid, posibil pulverizat pe un suport solid ca granule) şi evaluarea reproductibilităţii metodei de obţinere a acestuia
Studii in vitro de geno- şi citotoxicitate asupra extractului
Estimarea biodisponibilităţii fierului din extractul standardizat pe baza unei metode in vitro validate
Studii de preformulare şi formulare
Activităţile realizate în cadrul acestei etape, integrate cu cele din etapa precedentă a realizării proiectului au permis dezvoltarea unui număr de 4 modele experimentale:
a) Model experimental (EM2): caracterizarea fizico-chimică şi microbiologică a extractului standardizat
b) Model experimental (EM3): evaluarea genotoxicităţii extractului standardizat (pe celulă vegetală)
c) Model experimental (EM4): evaluarea citotoxicităţii extractului standardizat (pe celulă animală)
d) Model experimental (EM5): evaluarea disponibilităţii fierului pe baza unei metode in vitro validate
Acestea au stat la baza construirii unui Prototip al produsului finit (Pi) – un supliment alimentar conţinând fier de origine vegetală.
1. Cultivarea, colectarea şi/sau procesarea materialului vegetal de studiat
Deoarece pe baza activităților precedente s-a selectat o singură specie (Tagetes erecta L.) și un singur produs vegetal (folium) derivat de la aceasta pentru obținerea extractului final, în această fază s-a cultivat numai această specie vegetală, pe cele trei tipuri de soluri care au fost descrise în rapoartele anterioare.
2. Verificarea/Confirmarea identităţii şi purităţii produselor vegetale utilizate. Pentru aceleași considerente, verificarea/confirmarea identității s-a realizat în această etapă numai pentru acest produs vegetal, prin metodele simple şi clasice ale analizei farmacognostice aşa cum au fost prezentate în raportul precedent.
3. Obţinerea extractului standardizat (extract lichid, moale sau uscat; dacă este lichid, posibil pulverizat pe un suport solid ca granule) şi evaluarea reproductibilităţii metodei de obţinere a acestuia. Pe baza informațiilor furnizate de modelele funcționale (FM1-FM9) realizate anterior s-au selectat frunzele speciei Tagetes erecta L. pentru obținerea extractului standardizat. Selecția acestui produs vegetal s-a bazat pe conținutul în fier mai mare decât cel din rădăcini și tulpini și pe caracterul de organ vegetal regenerabil al frunzelor, ce poate fi colectat fără distrugerea plantei producătoare, spre deosebire de rădăcină. Solventul utilizat pentru obținerea extractului este reprezentat de apă acidulată cu acid citric (3%), soluția obținută prin refluxare se concentrează și apoi se supune liofilizării. Pentru evaluarea reproductibilității metodei de obținere a extractului au fost obținute 3 de serii experimentale de extract liofilizat din frunze de T. erecta, randamentele de obținere fiind similare.
4. Controlul fizico-chimic al extractului standardizat se realizează prin determinarea pierderii prin uscare, dozarea fierului, polifenolilor și flavonelor, precum și prin spectrul IR specific al extractului. Determinarea acestor parametri pe trei serii de extract a indicat o variabilitate relativ mică între serii și, deci, o bună reproductibilitate a metodei de obținere a acestuia. Pierderea prin uscare a extractului liofilizat a variat între 3,01 și 3,56%, conținutul mediu în fier a fost de 970,3-976,3 mg/kg, cel în polifenoli de 2,80-2,92% (echivalenți acid galic), iar cel în flavone a fost de 0,367-0,372 mg/kg.
5. Controlul microbiologic al extractului standardizat. Determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC = Total aerobic microbial count) și a numărului total combinat de levuri și fungi filamentoși (TYMC= Total combined yeasts/ moulds count) s-au realizat pe baza metodei numărătorii in placă în profunzime, oficializate în Farmacopeea Europeana, ediția în vigoare. Pentru cele trei serii de extract realizate, valorile obținute s-au înscris în limita compendială, acestea fiind astfel corespunzătoare din punctul de vedere al controlului microbiologic.
6. Studii in vitro de geno- şi citotoxicitate asupra extractului standardizat. S-a realizat evaluarea toxicității asupra radiculelor embrionare de Triticum aestivum L. (și a nucleului, respectiv cromozomilor celulelor meristematice respective) și evaluarea toxicității asupra naupliilor de Artemia franciscana (Kellog, 1906), nevertebrate crustacee. În ambele cazuri s-a observat toxicitate la toate nivelurile de concentrație utilizate (variind între 5% și, respectiv 0,05%), un efect care este însă cel mai probabil legat de pH acid creat de acidul citric, prezent din abundență în extract (din cauza solventului utilizat și păstrat în acesta pentru că are efecte biologice favorabile asupra absorbției fierului). Acest lucru a fost confirmat de testarea toxicității acidului citric și acidului ascorbic asupra radiculelor embrionare de T. aestivum L., la aceleași niveluri de concentrație ca și extractul; ambele substanțe naturale au fost toxice la toate nivelurile testate. Date din literatură au raportat de asemenea cito- și genotoxicitate pentru acidul citric pe limfocite periferice umane.
7. Estimarea biodisponibilităţii fierului din extractul standardizat pe baza unei metode in vitro validate. S-a utilizat un model in vitro propus pentru prima dată în 1981, care cu uşoare modificări a continuat să fie utilizat și în perioada actuală, fiind simplu, rapid și cu costuri relativ reduse în comparație cu modelele in vivo. Acesta a utilizat o etapă de simulare a digestiei gastrice (2 ore, mediu de digestie constând din 250 ml HCl 0,01 N conținând 1,25 g pepsină, mediu receptor format din acid clorhidric 0,01 N) și una de simulare a digestiei intestinale (2 ore, un mediu de digestie cu un volum de 300 ml, format din 250 ml HCl 0,01 N, la care s-au adăugat 40 ml NaHCO3 0,5M și 10 ml soluție de pancreatină și extract de bilă, mediu receptor NaHCO3 0,1M) și o membrană de dializă cu porozitate de 12.000 Da. Experimentul de simulare a absorbției gastrice a indicat că fierul dializează în proporție de 49,90% prin membrana semipermeabilă, în timp ce experimentul de simulare a absorbției intestinale a indicat o difuzie aproape totală a fierului prin membrana semipermeabilă (94,80%).
8. Studii de preformulare şi formulare. Pentru obținerea produsului s-au ales capsulele ca formă farmaceutică, luând în calcul avantajele pe care le prezintă acestea față de alte forme farmaceutice. S-a dezvoltat o formulă farmaceutică pentru capsule conținând 500 mg extract liofilizat din frunze de T. erecta L., iar ca excipienți amidon de porumb, talc și stearat de magneziu. S-au obținut 3 serii pilot pe baze formulei astfel dezvoltate.
Diseminarea rezultatelor cercetării s-a realizat în această etapă prin intermediul unui articol șiințific și prin două comunicări la conferințe internaționale.
Protecția rezultatelor cercetării s-a realizat prin depunerea spre aprobare la OSIM a unei cereri de brevet de invenție pentru extractul vegetal obținut.
Diseminare
1. Ancuceanu R, Aramă C, Neagu AF, Dinu M. Separarea şi dozarea acidului ascorbic prin HPLC: o analiză a literaturii ştiinţifice. Materialele Conferinţei Ştiinţifice Consacrate Jubileului de 50 de ani de la Fondarea Facultăţii de Farmacie şi 80 de ani de la Naşterea Patriarhului Farmaciei Moldave Vasile Procopişin (Revista Farmaceutică a Moldovei, 2014, nr. 3-4), p. 43
2. Ancuceanu VR, Arama C, Neagu AF, Dinu M, Hovaneţ MV, Olaru O, Popescu VC, Anghel AI. Ascorbic acid is virtually degraded in dried herbal products - an HPLC assessment of six plant species. Farmacia, 2015; 63 (5): 745-750
3. Ancuceanu R, Hovaneţ MV, Anghel AI, Olaru O, Popescu VC, Dinu M. Variation of polyphenol contents in vegetative organs of Tagetes erecta L. Priorities of Chemistry for a Sustainable Development, editia a XI - a Bucharest, 29th - 30th October 2015, International symposium - Book of Abstracts, BOOK OF ABSTRACTS, p. 13 (ISSN 2285 8334)
4. Ancuceanu, R.; Dinu, M.; Hovaneţ, M.V.; Anghel, A.I.; Popescu, C.V.; Negreş, S. A Survey of Plant Iron Content—A Semi-Systematic Review. Nutrients 2015; 7 (12): 10320-10351
5. Ancuceanu VR, Hovaneţ MV, Anghel AI, Dinu M, Dune A, Ciolea M, Olaru O, Popescu VC. Variation of polyphenols and iron concentration in Mentha x piperita L. by development stage and soil type. Articol acceptat pentru publicare de revista Farmacia.
6. R. Ancuceanu. Iron content of plants. Printech, Bucureşti, 2016, 393 pagini (carte).
7. Ancuceanu VR, Dinu M, Hovaneţ MV, Olaru O, Popescu VC, Anghel AI. Dificultăţi şi probleme în dozarea flavonoidelor din produsele vegetale prin două metode bazate pe complexarea cu clorură de aluminiu. Congresul Naţional de Farmacie din România, ediţia a XVI-a. Farmacia - centru al interdisciplinarităţii ştiinţelor vieţii. Volum de Rezumate, Bucureşti, 2016.
8. R. Ancuceanu, A. I. Anghel, M. V. Hovaneț, M. Dinu, O. T. Olaru, A. Dune, M. Ciolea, C.S. Stoicescu, C. Popescu. Variation of iron contents, polyphenols and flavonoids in Petroselinum crispum (Mill). Fuss (Apiaceae). Articol acceptat pentru publicare la Revista Farmacia (adeverință de acceptare nr. 33/29.09.2017).
9. A.I. Anghel, M.V. Hovaneț, M. Dinu, O.T. Olaru, Cristina S.Stoicescu, Carmen Popescu, Alina Dune, Robert Ancuceanu. Variation of mineral, polyphenol and flavonoid content by development stage in different parts of Urtica dioica l. Cultivated on three different soils. 3 rd International Conference on Natural Products Utilization: From Plants to Pharmacy Shelf ICNPU-2017, 18-21 October 2017 Bansko, BULGARIA (scrisoare de acceptare).
10. A.I. Anghel, M.V. Hovaneț, R. Ancuceanu, M. Dinu, C.S. Stoicescu, OT. Olaru, A. Dune, M. Ciolea, C. V. Popescu. Flavonoids, polyphenols and minerals from Acorus calamus L. (Acoraceae). PRIOCHEM 2017, Editia a XIII-a, 25-27 octombrie 2017, București (e-mail de acceptare, 28.09.2017).